Inleiding
Predictieve microbiologie, een specifieke discipline binnen de levensmiddelenmicrobiologie, poogt het microbieel gedrag te beschrijven aan de hand van wiskundige vergelijkingen. Voor de ontwikkeling van predictieve modellen moeten verschillende achtereenvolgende stappen ondernomen worden, nl. het uitdenken van het proefopzet, het verzamelen van de data, het identificeren van de modelvergelijkingen, het schatten van de parameters en tenslotte de modelvalidatie. Uiteindelijk kan dit proces leiden tot de ontwikkeling van een gebruiksvriendelijk software pakket dat gebruikt kan worden om de gevolgen in te schatten van veranderingen in het productieproces. Zowel groei, overleving als inactivatie van voedselpathogenen en bederforganismen kan voorspeld worden. De finale modellen kunnen onder meer ook gebruikt worden in HACCP plannen voor de bepaling van CCPs (kritische controlepunten) en corrigerende acties voor afwijkingen in productieprocessen te ondernemen. Niet alleen voor levensmiddelenproducenten maar ook voor onderwijsdoeleinden of overheden, kunnen predictieve modellen zeer nuttig zijn.
Predictieve modellen kunnen onderverdeeld worden in (i) kinetische modellen, d.w.z. de beschrijving van verandering in microbieel celaantal als functie van de tijd en (ii) probabilistische modellen, d.w.z. de beschrijving van de kans dat een specifiek fenomeen (groei, toxine productie,…) optreedt als functie van de intrinsieke en extrinsieke factoren.
Kinetische modellen
Deze modellen beschrijven de evolutie in microbieel celaantal als functie van de tijd (m.a.w. de verschillende fasen van een microbiële curve) voor een bepaald inoculumniveau, en vastgelegde intrinsieke (pH, aw, zuur concentratie,…) en extrinsieke factoren (temperatuur, atmosfeer,…). De meest gepubliceerde modellen beschrijven groeicurven van micro-organismen. Deze kunnen onderverdeeld worden in drie delen (lagfase, exponentiële groeifase en stationaire fase). Naast groeimodellen bestaan er ook modellen die overleving of inactivatie beschrijven.
Fasen in de microbiële groei
De klassieke celaantal-versus-tijd grafiek (Fig. 1) kan onderverdeeld worden in vier verschillende fasen, (i) de lagfase, (ii) de groeifase, (iii) de stationaire fase en (iv) de inactivatiefase.
Fig. 1: Illustratie van de verandering in celaantal als functie van de tijd
De lagfase
De lagfase stelt de tijd voor die een cel nodig heeft om zich aan te passen aan een nieuwe omgeving vooraleer groei kan optreden. Deze fase wordt sterk beďnvloed door de ‘voorgeschiedenis’ van het microorganisme. Hoe groter het verschil tussen het vorige groeimedium en het nieuwe groeimedium hoe langer de lagfase zal duren.
De groeifase
De groeifase beschrijft de verdubbeling van de micro-organismen en is enkel afhankelijk van de combinatie aan intrinsieke en extrinsieke factoren in het groeimedium. Deze fase wordt uitgedrukt aan de hand van de groeisnelheid (µ) of de generatietijd (GT) (of verdubbelingtijd) De groeisnelheid drukt de verandering in celaantal uit over een bepaalde tijdsperiode terwijl de generatietijd de tijd uitdrukt die één cel nodig heeft om tot twee cellen te delen. Beide parameters zijn als volgt aan elkaar gerelateerd:
|
Om groeidata voor te stellen, wordt het celaantal omgezet naar een log10 schaal. Dit laat toe om de groeifase lineair voor te stellen.
De stationaire fase
Deze fase stelt ook de maximale populatie dichtheid (MPD) voor en komt bijgevolg overeen met het maximale niveau dat het micro-organisme kan bereiken voor een specifieke combinatie aan intrinsieke en extrinsieke factoren. Dit niveau kan beďnvloed worden door de aanwezigheid van andere bacteriën, nutriëntlimitatie, productie van inhibitorische factoren, enz.
De inactivatie fase
Micro-organismen worden geďnactiveerd of afgedood als de condities te nadelig zijn om te overleven. Dit kan te wijten zijn aan verhoogde stresscondities in de media of na de stationaire fase door verlengde houdbaarheid. De vorm van de inactivatiecurve kan variëren afhankelijk van de intrinsieke en extrinsieke factoren. De curve kan ook onderverdeeld worden in drie fases, nl. De schouder (analoog aan de lagfase), de lineaire inactivatie fase en in sommige gevallen een staart.
Verschillende modelklassen
Primaire modellen
Deze modellen worden gefit aan de celaantal-versus-tijd data voor iedere specifieke combinatie aan intrinsieke en extrinsieke factoren. Verschillende technieken voor het fitten zijn mogelijk (vb. niet-lineaire regressie) die soms ook ingebouwd zijn in software programma’s voor het fitten van curven. Voor groeidata zijn de parameters meestal de lagfase, groeisnelheid, en maximale populatiedichtheid. Voor een inactivatiecurve zijn de parameters de initiële schouder, de reductie in celaantal (lineair) en eventueel ook de staart.
Secundaire modellen
Deze modellen beschrijven de verandering in de parameters van de primaire modellen als functie van de intrinsieke en extrinsieke factoren. Secundaire modellen kunnen eenvoudige linieare regressies zijn of meer complexe polynomische modellen.
Tertiaire modellen
De laatste stap bij de ontwikkeling van een predictief model beoogt het uitdrukken van de voorspellingen van een secundair model door een primair model. In dit geval zijn de inputfactoren de productkarakteristieken en de output een groei of inactivatiecurve (bv. Fig. 1). Deze modellen kunnen geďncorporeerd worden in spreadsheets of geprogrammeerd worden in software pakketten. Dit laat de eindgebruiker toe om voorspellingen te maken onder specifieke condities eigen aan een product.
Het moet echter wel opgemerkt worden dat voorspellingen van microbieel gedrag nooit 100% accuraat kunnen zijn. Variaties en onzekerheden kunnen veroorzaakt worden door experimentele fouten, stamvariatie en parameterschattingen van de primaire en secundaire modellen. Daarom worden kinetische modellen vaak voorgesteld met de onder- en bovenlimiet van het betrouwbaarheidsinterval.
Probabilistische modellen
Probabilistische groei/niet-groeimodellen kunnen beschouwd worden als een logische aanvulling op de kinetische modellen. Indien de omgevingscondities te stresserend worden, zal de groeisnelheid dalen tot nul en de lagfase oneindig worden of tenminste langer dan de duur van het experiment. Bij deze condities wordt de grens tussen groei en geen groei bereikt en moet het model verschuiven van een kinetisch naar een probabilistisch model. De output van een probabilistisch model drukt de kans uit dat een specifiek fenomeen zal optreden binnen een gegeven tijdspanne (Fig. 2). De tijdsperiode waarover de experimenten uitgevoerd worden is een belangrijk criterium aangezien bij een bepaalde combinatie aan omgevingsfactoren een experiment kan evolueren van ‘geen groei’ naar ‘groei’, indien de analyseperiode verlengd zou worden.
Voor probabilistische modellen zullen de uitkomsten, onder specifieke omgevingsconidities en in een gegeven tijdspanne, gecodeerd worden als 0 (fenomeen niet waargenomen) of 1 (fenomeen waargenomen). Wanneer herhaaldelijke observaties uitgevoerd worden bij eenzelfde conditie wordt een probabiliteit bekomen tussen 0 en 100%. Om deze probabiliteit te linken met de variabelen (intrinsieke en extrinsieke factoren), worden logistische regressiemodellen gebruikt. Deze statistische modelleertechniek wordt vooral gebruikt als de uitkomst categorisch is.
Fig. 2: Illustratie van een groei/niet-groeimodel. Fictieve datapunten: (o) geen groei, (+) groei.
Lijnen stellen de voorspellingen van het logistische regressiemodel voor p = 0.9 (_____), p = 0.5 (- - -), p = 0.1 (• • •)